1.流動相溶劑應(yīng)選擇HPLC的溶劑或依此為標(biāo)準(zhǔn)的溶劑。流動相使用前用0.45μm濾膜過濾、脫氣,清除微粒和灰塵。在送液泵內(nèi),為了防止雜物(固體)進(jìn)入流路,裝有吸濾器,但網(wǎng)孔徑為10μm,比此更小的顆粒仍然可通過,這會導(dǎo)致流路和柱子堵塞和污染。為此,建議常用0.45μm濾膜過濾。流動相溶劑須經(jīng)脫氣,如不脫氣,在溶劑混合時,或壓力溫度變化時容易產(chǎn)生大量氣泡,會導(dǎo)致泵誤動作和輸液不暢,檢測器產(chǎn)生噪聲信號等。
2.流動相恢復(fù)到室溫后使用。流動相溫度與室溫相差時,流動相在恢復(fù)到室溫前,基線水平很難穩(wěn)定,特別是發(fā)生漂移,也容易產(chǎn)生氣泡等現(xiàn)象。水與有機(jī)溶劑混合時,混合液變化大,往往會與室溫相差很大,務(wù)必注意。
3.做HPLC流動相的試劑應(yīng)用HPLC級的、水應(yīng)用二次蒸餾水,水相流動相需經(jīng)常更換,防止長菌變質(zhì)。使用去離子水、針劑水、純凈水(炊用)并不合適、尤其是做梯度洗脫時,水中的不純物會成為鬼峰,從而干擾分析結(jié)果。
4.流動相的pH值過高或過低,流動相使用純水,使用高濃度磷酸鹽緩沖溶液,使用離子對試劑等,均可能造成色譜柱填料被化學(xué)破壞,這種對色譜柱固定相及鍵合相的破壞通常是不可修復(fù)的
5.用緩沖鹽做流動相時,在使用前和使用后都要用水清洗流路,絕對禁止將緩沖溶液留在流路中靜置過夜或更長時間。
6.若需要使用含鹽的流動相,使用前請過濾。并且使用該含鹽流動相前,色譜柱需先用低比例有機(jī)相(有機(jī)相含量應(yīng)不低于10%)的溶液沖洗,以免緩沖鹽析出。流動相若為蒸餾水或含鹽的緩沖液,建議現(xiàn)用現(xiàn)配,以免流動相因滋生微生物而造成柱填料的污染。
7.進(jìn)行梯度實(shí)驗(yàn)時要注意梯度變化過程中流動相的互溶性,避免因流動相不互溶而導(dǎo)致的緩沖鹽析出問題。反相系統(tǒng)更換正相系統(tǒng)或正相系統(tǒng)更換反相系統(tǒng)時,用異丙醇置換系統(tǒng)內(nèi)的儲存流動相后在接柱子。
8.在更換兩種互不相溶的流動相時,中間要用異丙醇溶液清洗過渡。例如:先用甲醇水做流動相,然后在用正己烷做流動相時,一定要先用異丙醇溶液沖洗甲醇水,然后用正己烷沖洗異丙醇,反之也是一樣。在更換流動相時還要考慮色譜柱是否更換。
9.儀器在短期(兩三天)不用時,流路中可以是甲醇或水。儀器在長期不用時,流路中應(yīng)用甲醇。
10.對于UV等檢測器用于高靈敏度檢測時,要使用UV吸收性小的HPLC的溶劑作為流動相溶劑,如甲醇、乙腈等。
11.當(dāng)流動相溶劑為乙腈時,流速為1ml/min泵的正常壓力5~7Mpa之間,如果壓力逐漸降低,基線也出現(xiàn)異常。這是由于乙氰的粘性大,導(dǎo)致泵的流速降低。可適當(dāng)提高流速使泵的壓力恢復(fù)正常即可。
12.流動相含有濃硫酸、濃硝酸、二氯,乙酸、二氯甲烷、氯仿、丙酮、四氯呋南、二甲化砜等溶劑,會對流路中的PEEK樹脂管路強(qiáng)度變成差、PEEK樹脂管容易破裂使溶劑外濺。流動相含有鹵素離子的溶劑,如KCI、NaCI、NH4CI等。對流路中的不銹鋼材料有腐蝕作用,以上的溶劑須盡量避免使用。非用不可時,分析完了后,應(yīng)立刻用蒸餾水把全流路清洗干凈。
13.用于檢定梯度等性能時,短時間使用在0.5%以下的低濃度丙酮水溶液是沒有問題的。
14.注意:稀硝酸與甲醇不能混合,否則有可能會引起爆炸。